CVPH. Ngô Thị Lan Phương
Đơn vị HTSS IVFMD FAMILY, BVĐK Gia Đình, Đà Nẵng

Môi trường nuôi cấy phôi (spent embryo culture medium - SECM) hỗ trợ cho sự phát triển của phôi từ khi hình thành cho đến khi chuyển phôi, đóng vai trò then chốt trong thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON). Trong quá trình nuôi cấy, một tương tác tích cực giữa phôi và môi trường diễn ra, phôi giải phóng các chất gọi là secretome vào môi trường ngoại bào. Các phân tử này có thể đóng vai trò là dấu ấn sinh học không xâm lấn về chất lượng phôi và là nguồn nguyên liệu tiềm năng cho xét nghiệm di truyền tiền làm tổ. Các phân tích di truyền đã đánh giá các phân tử tiết ra từ phôi bao gồm: DNA tự do (cell-free DNA-cfDNA), DNA ty thể (mitochondrial DNA-mtDNA), các phân tử RNA, protein, chất chuyển hóa và túi ngoại bào [1].

1. Phân tích cfDNA trong môi trường nuôi cấy

cfDNA được phôi giải phóng vào SECM và có thể thực hiện xét nghiệm di truyền không xâm lấn (non-invasive preimplantation genetic testing-niPGT). cfDNA phôi có thể có nguồn gốc từ khối tế bào nội mô (inner cell mass-ICM) và tế bào TE, có liên quan chặt chẽ đến cơ chế apoptosis [2]. Điều này cho thấy tính chính xác của cfDNA trong việc biểu hiện kết quả di truyền của phôi đang phát triển [1]. Hàm lượng và kích thước cfDNA trong môi trường nuôi cấy có thể thay đổi tùy thuộc vào giai đoạn phát triển của phôi, với nhiều cfDNA có sẵn trong môi trường nuôi cấy hơn ở giai đoạn phôi nang. Do đó, việc nuôi cấy phôi kéo dài trong SECM cho đến ngày thứ 5 và ngày thứ 6 là rất quan trọng, vì hàm lượng DNA cao hơn trong môi trường cần phân tích. Một nghiên cứu năm 2019 đã báo cáo tỷ lệ tương thích cao của cfDNA với trình tự toàn bộ bộ gen phôi so với tế bào TE (lần lượt là 93,8% so với 82,0%) [2]. Bên cạnh đó, cfDNA trong môi trường nuôi cấy có thể thực hiện PGT để xác định các trường hợp lệch bội (PGT A), cung cấp những hiểu biết có giá trị về các bất thường nhiễm sắc thể (NST) mà không cần xâm lấn phôi để sinh thiết. Hơn nữa, một số nghiên cứu cho thấy niPGT-A ít bị lỗi liên quan đến phôi khảm và cho thấy độ tin cậy cao hơn so với PGT trên tế bào TE [3].
Mối liên quan giữa nồng độ cfDNA trong môi trường nuôi cấy với kết quả IVF và hệ thống miễn dịch của mẹ cũng đã được đánh giá. Tuy nhiên, các nghiên cứu chỉ ra rằng không có mối liên quan giữa nồng độ cfDNA với tỷ lệ làm tổ, dự đoán thai kỳ đang diễn ra hoặc hệ thống miễn dịch của mẹ. Do đó, việc sử dụng nồng độ cfDNA làm dấu ấn sinh học dự đoán tỷ lệ thành công trong HTSS hiện nay là một phương pháp còn nhiều hạn chế. Hơn nữa, phương pháp niPGT còn nhiều hạn chế và thách thức, như lượng cfDNA thấp, nguy cơ ảnh hưởng bởi DNA từ mẹ và sự hiện diện của cfDNA trong chính môi trường nuôi cấy. Nhìn chung, những lợi thế của phân tích cfDNA không xâm lấn là một phương pháp đơn giản mà không cần thao tác trên phôi, cung cấp dự đoán tốt về chất lượng phôi, tuy nhiên việc dự đoán tỷ lệ thành công trong HTSS vẫn chưa rõ ràng [1].

2. Khả năng phát hiện mtDNA

Ty thể có cấu trúc DNA độc lập với DNA nhân, chứa thông tin di truyền quan trọng cho quá trình sản xuất năng lượng và chuyển hóa tế bào. Ty thể và mtDNA cũng có tác động đến sự phát triển phôi sớm. Nghiên cứu gần đây cho thấy khi phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang, ty thể nội bào trải qua quá trình nhân lên đáng kể, tạo ra hàng triệu bản sao mtDNA trong một tế bào TE. Trong giai đoạn này, DNA từ dịch phôi nang và phôi được giải phóng vào môi trường nuôi cấy có thể được chiết xuất và đo lường [4].
Tương tự như DNA nhân, mtDNA đã được phát hiện trong SECM, với hàm lượng mtDNA cao hơn so với DNA nhân, có thể chỉ ra số lượng bản sao mtDNA tăng cao trong quá trình phát triển phôi. Hàm lượng mtDNA tăng cũng có thể là do sự nhiễm bẩn từ các tế bào cumulus, tuy nhiên, số lượng bản sao mtDNA của các tế bào cumulus đã được chứng minh là thấp hơn đáng kể so với các tế bào phôi tiền làm tổ. Những phát hiện này cho thấy rằng mtDNA trong SECM có thể đóng vai trò là dấu hiệu dự đoán để đánh giá chất lượng phôi nang nở rộng [1].
Bên cạnh đó, khi xem xét mối quan hệ giữa tuổi mẹ và hàm lượng mtDNA trong SECM, kết quả cho thấy ở phụ nữ lớn tuổi, chất lượng và số lượng ty thể giảm, cùng với sự gia tăng phân mảnh và tỷ lệ lệch bội NST cao hơn, có khả năng liên quan đến tỷ lệ phôi chậm phát triển và thất bại làm tổ cao. Trong một nghiên cứu khác, hàm lượng mtDNA trong SECM cho thấy mối tương quan với tỷ lệ phân mảnh phôi vào ngày 2 và ngày 3 của quá trình phát triển, không phụ thuộc vào tuổi mẹ [5].
Tác động của tỷ lệ mtDNA/genome DNA trong SECM ở giai đoạn ngày 3 đối với khả năng sống của phôi và tiềm năng làm tổ cũng đã được đánh giá. Tỷ lệ mtDNA/genome DNA cao hơn ở SECM tương quan với khả năng phát triển đến giai đoạn phôi nang, cải thiện chất lượng phôi nang và tăng tỷ lệ làm tổ nhưng chưa đạt đến mức có thể dự báo các yếu tố lâm sàng. Tuy nhiên, không tìm thấy mối liên quan nào giữa hàm lượng mtDNA và khả năng sinh con [1].

3. Phân tích RNA phôi trong SECM

Các phân tử RNA có nhiều vai trò khác nhau trong tế bào. Ngoài mRNA, mang thông tin di truyền cần thiết cho quá trình tổng hợp protein, các phân tử RNA không mã hóa (ncRNA) đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa biểu hiện gen, bảo vệ bộ gen khỏi virus và các yếu tố chuyển vị. Các phân tử RNA đã được phát hiện trong SECM như RNA vận chuyển (transfer RNA-tRNA), RNA nhỏ từ tRNA (tRNA-derived small RNA-tsRNA), microRNA (miRNA), RNA can thiệp nhỏ (small interfering RNA-siRNA) và RNA tương tác PIWI (PIWI-interacting RNA-piRNA), ncRNA dài (long ncRNA-lncRNA). Các phân tử RNA như miRNA, tRNA và piRNA là những phân tử được nghiên cứu nhiều nhất, như các dấu ấn sinh học SECM tiềm năng về chất lượng phôi và khả năng làm tổ.

1. siRNA, lncRNA

siRNA, thuộc nhóm ncRNA, bao gồm các phân tử RNA điều hòa ngăn chặn biểu hiện gen bằng cách phân hủy trực tiếp mRNA và bảo tồn cấu trúc chromatin nhỏ gọn. siRNA, cùng với các ncRNA khác, rất cần thiết cho quá trình chuyển đổi từ mẹ sang hợp tử [1]. Có bằng chứng về sự hiện diện của siRNA trong SECM, nhưng thông tin liên quan đến chất lượng phôi hoặc tiềm năng làm tổ vẫn chưa được làm sáng tỏ. Đối với lncRNA, đã được xác nhận có sự hiện diện trong SECM nhưng có rất ít thông tin về tiềm năng của nó như một dấu ấn sinh học về chất lượng phôi và tỷ lệ làm tổ.

1. mRNA

Các gen mã hóa protein mRNA có mặt với hàm lượng lớn trong SECM, những mRNA này phản ánh chính xác gen phôi do có mối tương đồng giữa các gen được biểu hiện bởi phôi nang và các gen được phát hiện trong SECM. Trong giai đoạn đầu của quá trình phát triển tiền làm tổ, các thể cực bị phân hủy cũng là một nguồn mRNA tiềm năng trong SECM. Một nghiên cứu trước đây đã phát hiện ra 232 bản sao gen có biểu hiện khác biệt trong SECM, có khả năng phân biệt giữa phôi nang chất lượng cao và chất lượng thấp. Những gen này có liên quan đến nhiều quá trình khác nhau như dịch mã, con đường truyền tín hiệu miễn dịch và chuyển hóa axit amin. Tuy nhiên, cần nghiên cứu thêm để hiểu mối liên hệ của chúng với chất lượng của phôi nang.

1. tsRNA

tsRNA được cho là một trong những sncRNA lâu đời nhất, tham gia vào nhiều quá trình sinh học khác nhau, đặc biệt là trong việc điều hòa biểu hiện gen, stress oxy hóa, điều hòa biểu sinh, tăng sinh tế bào, apoptosis và phản ứng miễn dịch. tsRNA là ncRNA được biểu hiện cao, có khả năng liên kết với mRNA tương tự như miRNA, do đó điều chỉnh biểu hiện của các gen mục tiêu. Những đoạn RNA nhỏ này được phôi tiết vào SECM, cho thấy vai trò của chúng trong quá trình phát triển phôi sớm, làm tổ và khả năng tiếp nhận nội mạc tử cung, và có thể đóng vai trò là dấu ấn sinh học về chất lượng phôi. Trong một nghiên cứu gần đây của Xiong và cộng sự, tsRNA trong SECM của phôi từ 1 đến 3 ngày tuổi đã được phân tích bằng phương pháp phân tích PCR định lượng, phát hiện có liên quan đến chất lượng phôi và tiềm năng làm tổ. Nghiên cứu này đã phát hiện ra sự gia tăng biểu hiện của 9 tsRNA trong SECM từ phôi chất lượng cao và 37 tsRNA trong SECM từ phôi chất lượng thấp, trong đó một số phân tử được phát hiện đã được xác nhận. Phân tử tiRNA-1:35-Leu-TAG-2, được giải phóng bởi phôi chất lượng thấp, đã được nghiên cứu sâu hơn trong tương tác phôi-nội mạc tử cung, trong đó sự gắn kết giảm của các khối cầu JAr với các tế bào nội mạc tử cung đã được báo cáo [6].

1. miRNA là dấu ấn sinh học trong SECM

 Phôi đã được chứng minh là giải phóng các phân tử miRNA khác nhau vào môi trường ngoại bào, làm trung gian cho sự tương tác giữa phôi nang và nội mạc tử cung, điều này rất quan trọng đối với quá trình làm tổ của phôi. miRNA liên quan đến quá trình biệt hóa phôi nang, với tế bào TE là nguồn chính của miRNA trong SECM [1]. Capalbo và cộng sự là những người đầu tiên khám phá tiềm năng định lượng miRNA trong SECM, chứng minh hai miRNA là các dấu ấn sinh học tiềm năng để lựa chọn phôi: miR-20a và miR-30c với mức biểu hiện tăng lên (96%) trong phôi nang được làm tổ. Chức năng của miR-20a có liên quan đến sự hình thành mạch máu, apoptosis, tăng sinh và phát triển tế bào, khả năng sống, chu kỳ tế bào và làm tổ. miR-30c, thuộc họ miR-30, có liên quan đến cơ chế sinh bệnh của các bệnh lâm sàng và được tiết ra bởi các tế bào TE, đóng vai trò quan trọng trong việc xác định tiềm năng của phôi. miR-30c tham gia vào việc điều hòa các con đường sinh học liên quan đến sự tăng sinh, giao tiếp và truyền tín hiệu của tế bào [7]. Nhiều miRNA đã được phát hiện trong SECM và dường như là những dấu ấn sinh học tiềm năng để đánh giá chất lượng phôi và dự đoán thành công trong HTSS, bao gồm miR-20a, miR-30c, miR-199a-5p, miR-634, miR-29c-3p, let-7i-5p và let-7b-5p... Mặt khác, một số miRNA có mức độ biểu hiện cao, chẳng hạn như miR-661, miR-372, miR-519d-3p, miR-483-5p, miR-432-5p, miR-21-5p và miR-26b-5p, có thể liên quan đến tỷ lệ thất bại trong HTSS [1].

1. piRNA trong môi trường nuôi cấy

Trong sinh sản, các phân tử piRNA đóng vai trò như “người bảo vệ bộ gen” thông qua việc làm bất hoạt các yếu tố chuyển vị sau phiên mã, từ đó bảo tồn tính toàn vẹn của bộ gen. Các nghiên cứu về piRNA trong SECM cho thấy nó có liên quan đến hình thái phôi và tiềm năng làm tổ, sự khác biệt về mức độ biểu hiện của piR-16735, piR-17716, piR-19675, piR-20326, piR-20401 và piR-20497, với piR-20401 và piR-20497 cho thấy mối liên hệ cao nhất với kết quả làm tổ. Hơn nữa, piRNA có trong SECM điều chỉnh các quá trình trong phát triển phôi sớm đã được nghiên cứu, xác định các phân tử được biểu hiện cao trong SECM ở giai đoạn phôi dâu phát triển đến giai đoạn phôi nang với các thông số hình thái tốt/xuất sắc, chúng bao gồm piR-11291, piR-1311, piR-15462, piR-16735, piR-19122, piR-19675, piR-20381, piR-4880, piR-15026, piR-807 và piR-20485. Gần đây, nhiều nghiên cứu cho thấy sự kết hợp của năm phân tử piRNA (piR-28263, piR-18682, piR-23020, piR-414 và piR-27485) cùng với hai miRNA (miR-16-5p và miR-92a-3p) có thể được sử dụng để phân biệt phôi chất lượng cao với phôi chất lượng thấp với xác suất 86% [8].

4. Phân tích proteme trong SECM

Môi trường nuôi cấy phôi chứa các protein khác nhau được tiết ra trong quá trình phát triển của phôi, bao gồm cytokine, TNFR1, interleukin-6 (IL-6), yếu tố tăng trưởng mạch máu nội mô A (vascular endothelial growth factor A-VEGFA), chất cảm ứng metalloproteinase (extracellular matrix metalloproteinase inducer-EMMPRIN), yếu tố tăng trưởng nhau thai (placental growth factor-PLGF), phân tử kết dính tế bào biểu mô (epithelial cell adhesion molecule-EpCAM), caspase 3, glycoprotein giàu histidine (histidine-rich glycoprotein-HRG) và kháng nguyên bạch cầu người G (human leukocyte antigen G-HLA-G) [9].
Sự gia tăng biểu hiện của VEGF-A, IL-6, HRG và EMMPRIN trong SECM có liên quan đến thời gian hình thành phôi dâu ngắn hơn và chất lượng phôi nang cao hơn, ngược lại nồng độ caspase 3 thấp hơn. HLA-G trong môi trường nuôi cấy được phát hiện có mối tương quan thuận với khả năng làm tổ của phôi và kết quả thai kỳ thành công. HLA-G có chức năng quan trọng trong khả năng dung nạp miễn dịch giữa mẹ và thai nhi. Nó được biểu hiện bởi các tế bào lá nuôi ngoài nhung mao và tham gia vào quá trình tiết cytokine trong quá trình làm tổ [1].
Một tập hợp các cytokine (IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, yếu tố ức chế bệnh bạch cầu [leukaemia inhibitory factor-LIF] và yếu tố kích thích khuẩn lạc bạch cầu hạt-đại thực bào [granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-GM-CSF]) đã được đánh giá trong SECM như các dấu hiệu của chất lượng phôi, do chúng liên quan đến sự phát triển phôi, biệt hóa và các sự kiện làm tổ qua trung gian miễn dịch. Trong giai đoạn bám dính, phôi nang bám vào biểu mô tử cung bằng các phân tử bám dính, phối tử, yếu tố tăng trưởng và một số cytokine nhất định. Vai trò quan trọng của cytokine trong quá trình làm tổ phôi là những chỉ số đầy hứa hẹn để dự đoán sự thành công của quá trình làm tổ.
Nhìn chung, phân tích proteome hiện nay có nhiều thách thức, đặc biệt là do nồng độ albumin cao có trong môi trường nuôi cấy, vì chúng có thể làm phức tạp việc phân tích các protein khác có trọng lượng phân tử tương tự (60–70 kDa). Phân tích proteome còn gặp nhiều thách thức hơn nữa do tính phức tạp chưa biết của nó (cắt nối thay thế, biến thể trình tự, sửa đổi biểu sinh và sau dịch mã). Bất chấp những thách thức này, phân tích proteome là một công cụ tiến bộ không ngừng cho nghiên cứu về dấu ấn sinh học vì nó 'gần nhất' với kiểu hình.

5. Các chất chuyển hóa trong SECM

Mặc dù các chất chuyển hóa tham gia tích cực vào quá trình phát triển phôi sớm, nhưng có rất ít nghiên cứu về tiềm năng của các dấu ấn sinh học chuyển hóa trong SECM. Các nghiên cứu trong tương lai nên cung cấp đầy đủ tiềm năng của nghiên cứu chuyển hóa trong SECM như các dấu ấn không xâm lấn đánh giá chất lượng phôi và thành công của thụ tinh trong ống nghiệm (IVF).

6. Vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy

Mặc dù nhiều phòng thí nghiệm IVF sử dụng môi trường nuôi cấy có chứa kháng sinh để giảm thiểu nguy cơ phát triển vi khuẩn, nhưng việc tránh nhiễm khuẩn gần như là không thể. Nguồn vi khuẩn chính trong SECM là tinh dịch, dịch nang trứng là tác nhân gây nhiễm khuẩn phổ biến thứ hai. Trong một nghiên cứu gần đây, không tìm thấy mối liên hệ đáng kể nào giữa sự hiện diện của vi sinh vật trong SECM và tỷ lệ mang thai, số lượng phôi được thụ tinh bình thường, số lượng phôi khả dụng hoặc số lượng phôi chất lượng tốt [10]. Điều này cho thấy hệ vi sinh vật có thể ảnh hưởng đến chất lượng phôi, mặc dù tác động của nó đối với kết quả HTSS vẫn chưa rõ ràng. Trong hầu hết các nghiên cứu, không thể xác định nguồn gốc của vi khuẩn trong SECM, và việc bản thân phôi có thể tiết ra những vi sinh vật này hay không vẫn còn là một dấu hỏi. Điều hiển nhiên là quá trình thụ thai tự nhiên không diễn ra trong môi trường vô trùng và IVF cũng không diễn ra trong môi trường vô trùng. Do đó, có khả năng vi sinh vật từ SECM có thể tác động khác nhau đến kết quả HTSS và chất lượng phôi, mặc dù cần nghiên cứu thêm để xác định mối liên hệ này [1].
KẾT LUẬN
Mục tiêu của HTSS là đạt được một thai kỳ thành công, dẫn đến sự ra đời của một em bé khỏe mạnh. Sẽ rất lý tưởng nếu có thể xác định các dấu ấn sinh học không xâm lấn, cho phép lựa chọn phôi tốt nhất, khỏe mạnh nhất với tiềm năng làm tổ cao. Các phương pháp phân tích không xâm lấn là những công cụ đầy hứa hẹn nhưng dễ gặp phải những hạn chế như khả năng phát hiện, sự khác biệt trong bộ gen và bản sao, mức độ chuyển hóa tế bào và nhiễm bẩn. Việc điều chỉnh theo sự khác biệt về điều kiện nuôi cấy trong mỗi phòng thí nghiệm và đặc điểm của từng cá nhân cũng rất khó khăn. Tuy nhiên, phân tích môi trường nuôi cấy phôi nổi lên như một công cụ đầy hứa hẹn để đánh giá chất lượng phôi không xâm lấn và dự đoán thành công trong HTSS. Tuy nhiên vẫn cần nghiên cứu thêm với quy mô mẫu lớn hơn, các nhóm dân tộc khác nhau và các thử nghiệm có đối chứng ngẫu nhiên trước khi đưa bất kỳ dấu ấn sinh học SECM phân tử nào vào thực hành lâm sàng.
Tài liệu tham khảo
[1]        S. Toporcerová et al., “Embryo secretome in predicting embryo quality and IVF treatment outcome,” Reproductive BioMedicine Online, vol. 51, no. 1, Jul. 2025, doi: 10.1016/j.rbmo.2025.104825.
[2]        N. Handayani et al., “The origin and possible mechanism of embryonic cell-free DNA release in spent embryo culture media: a review,” J Assist Reprod Genet, vol. 40, no. 6, pp. 1231–1242, Jun. 2023, doi: 10.1007/s10815-023-02813-z.
[3]        “Noninvasive preimplantation genetic testing for aneuploidy in spent medium may be more reliable than trophectoderm biopsy - PubMed.” Accessed: Jul. 17, 2025. [Online]. Available: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31235575/
[4]        X. Zhang et al., “Mitochondrial DNA and genomic DNA ratio in embryo culture medium is not a reliable predictor for in vitro fertilization outcome,” Sci Rep, vol. 9, no. 1, p. 5378, Mar. 2019, doi: 10.1038/s41598-019-41801-1.
[5]        S. Stigliani, P. Anserini, P. L. Venturini, and P. Scaruffi, “Mitochondrial DNA content in embryo culture medium is significantly associated with human embryo fragmentation,” Hum Reprod, vol. 28, no. 10, pp. 2652–2660, Oct. 2013, doi: 10.1093/humrep/det314.
[6]        Y. Xiong et al., “Differential expression of tsRNAs and miRNAs in embryo culture medium: potential impact on embryo implantation,” J Assist Reprod Genet, vol. 41, no. 3, pp. 781–793, Mar. 2024, doi: 10.1007/s10815-024-03034-8.
[7]        “MicroRNAs in spent blastocyst culture medium are derived from trophectoderm cells and can be explored for human embryo reproductive competence assessment - Fertility and Sterility.” Accessed: Jul. 17, 2025. [Online]. Available: https://www.fertstert.org/article/S0015-0282(15)01931-7/fulltext
[8]        S. Toporcerová et al., “Small Non-Coding RNAs as New Biomarkers to Evaluate the Quality of the Embryo in the IVF Process,” Biomolecules, vol. 12, no. 11, p. 1687, Nov. 2022, doi: 10.3390/biom12111687.
[9]        “Characterization and quantification of proteins secreted by single human embryos prior to implantation - PubMed.” Accessed: Jul. 17, 2025. [Online]. Available: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26471863/
[10]      “Vertical transmission of microbiomes into embryo culture media and its association with assisted reproductive outcomes - PubMed.” Accessed: Jul. 17, 2025. [Online]. Available: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38824761/